淺談用于廣東蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測的幾種生物識別酶
廣東作為我國蔬菜出口的一枝獨(dú)秀，但有機(jī)磷類農(nóng)藥的施用也對廣東蔬菜的發(fā)展提出了挑戰(zhàn)，使其有機(jī)磷農(nóng)藥殘留速測技術(shù)具有重要的應(yīng)用意義。當(dāng)前色譜法雖然分析精度高、定量準(zhǔn)確，但樣品的前處理復(fù)雜、檢測耗時長、成本高、需要技術(shù)熟練的操作人員，不適合市場管理部門經(jīng)常性的現(xiàn)場檢測。開發(fā)和推廣適合我國產(chǎn)品產(chǎn)銷特點(diǎn)的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)成為控制當(dāng)前農(nóng)藥殘留的關(guān)鍵技術(shù)措施。農(nóng)藥殘留檢測中常用到土壤分析儀來測定土壤中氮、磷的含量，從而確定是否施用了農(nóng)藥。
一、乙酰膽堿酯酶
(一)分布及生化特性
乙酰膽堿酯酶被稱為真性或特異性膽堿酯酶，主要存在于哺乳動物的紅細(xì)胞及神經(jīng)組織中，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)、運(yùn)動神經(jīng)板及發(fā)電器官中，是維持體內(nèi)正常神經(jīng)功能的非常重要的一類水解酶。膽堿酯受膽堿酯酶水解首先形成一個Michaelis 酶—底物絡(luò)和物，接著�；D(zhuǎn)移到酯酶分子上去，形成�；ッ�，最后迅速水解，使酶失活的催化作用來自酶蛋白分子本身的結(jié)構(gòu)，不需任何特異性輔基或金屬離子參與。另一催化底物水解過程，為酯動部位或催化部位。以含有一個陽離子基的酯作為底物，其活性區(qū)里有一個陰離子部位，以便吸引和連接底物，使其易于受酯動部位的進(jìn)攻。
(二)作用機(jī)制及應(yīng)用情況
有機(jī)磷和氨基甲酸酯類化合物是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，通過與活性位點(diǎn)的絲氨酸（Ser200）殘基形成共價鍵而抑制乙酰膽堿酯酶的活性，選擇合適的底物，根據(jù)有機(jī)磷對該酶的抑制程度不同而影響產(chǎn)物的量，通過比色法可測定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量。目前，廣州、深圳、珠海、惠州、香港等城市都已把農(nóng)藥速測卡作為常規(guī)的檢測方法，采用的即為對農(nóng)藥高度敏感的膽堿酯酶和顯色劑做成的酶試紙。國內(nèi)由于技術(shù)等方面原因難以實(shí)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶純品的大量制備，從來源豐富的羅非魚頭部提取乙酰膽堿酯酶粗酶液，通過檢測酶活性及對不同濃度農(nóng)藥的抑制率及與標(biāo)準(zhǔn)方法的對比試驗(yàn)，得出此粗酶液可用于快速檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留，可為基層單位提供一個應(yīng)急、簡便的檢測手段。同時果蠅的敏感頭部也是乙酰膽堿酯酶的重要來源，我國農(nóng)業(yè)部曾對酶抑制快速檢測法的幾個關(guān)鍵步驟進(jìn)行反復(fù)的比較試驗(yàn)，對敏感家蠅頭乙酰膽堿酯酶與有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了敏感度的試驗(yàn)。
二、丁酰膽堿酯酶
(一)分布及生化特性
血清丁酰膽堿酯酶是由四個亞基組成的糖蛋白，分子量28 萬～35 萬。作為一類糖蛋白，主要存在于腦、肝、血及膽堿能神經(jīng)末稍的突觸間隙中，主要由肝臟合成，并存在于血清中，生理作用不明，稱為假性膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶Lockridge 等采用Edman 降解法測定了人血清BChE 完整的氨基酸序列，共含有574 個氨基酸殘基。BChE 氨基酸序列與其他酯酶家族蛋白有很高的同源性。以電鰩AChE 的三維結(jié)構(gòu)為模板對人BChE 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行計算機(jī)模擬結(jié)果表明，BChE 活性中心，囊袋的底部為Ser198，其兩側(cè)相距一定距離分別是�；Y(jié)合部位和膽堿結(jié)合部位。研究發(fā)現(xiàn)人BChE 的氨基酸序列上有Zn2+ 離子結(jié)合結(jié)構(gòu)。
(二)作用機(jī)制及應(yīng)用情況
丁酰膽堿酯酶能與有機(jī)磷毒劑或殺蟲劑結(jié)合，并能水解許多酯類、肽類及酰胺類化合物，對這些化合物的中毒具有防治作用。目前應(yīng)用較為廣泛的為用于體外定量測定人血清或其他體液中膽堿酯酶的活力。測定血清膽堿酯酶活性是協(xié)助診斷有機(jī)磷中毒和評估實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害的重要手段，有機(jī)磷通過與活性位點(diǎn)的絲氨酸（Ser200）殘基形成共價鍵而抑制酯酶的活性。
三、植物膽堿酯酶
(一)分布及生化特性
植物膽堿酯酶是酯酶- B 中的一種膽堿酯酶，其對有機(jī)磷酸酯分子敏感，通常稱為絲氨酸水解酶、脂族酯酶或非特異性酯酶，廣泛存在于植物體內(nèi)，不同植物種類和生長期其含量不同。雖然植物中的膽堿酯酶活性比乙酰膽堿酯酶的活性略低，但其來源豐富、成本低，開始受到國內(nèi)學(xué)者的關(guān)注。
(二)作用機(jī)制及應(yīng)用情況
植物膽堿酯酶可以使a- 乙酸萘酯水解為萘酚和乙酸，萘酚與顯色劑固藍(lán)B 鹽作用形成紫紅色的偶氮化合物，利用該原理測定該物質(zhì)的吸光度值變化既可知酶的活性大小。周艷明等從蕎麥面粉中提取得到植物酯酶，粗酶經(jīng)硫酸銨分級沉淀、Q- Sepharose Fast Flow 離子交換柱層析后酶活可提純16.814 倍，純酶液經(jīng)Sephadex G- 200 層析和HPLC 分析證明為單一物質(zhì)[2]，阮長青等從小麥中提取了植物酯酶，并進(jìn)行了其催化反應(yīng)的動力學(xué)特性、以及抑制有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的定性、定量研究。由于酶特性及抑制作用發(fā)生在特定條件下，各種外源干擾可能對酶活性及抑制作用程度帶來影響，采用相應(yīng)方法建立有機(jī)磷農(nóng)藥與酶的抑制關(guān)系時，會引起檢測的靈敏度下降、抑制曲線的線性范圍較窄、檢出下限較高的問題，但對于廣東農(nóng)殘現(xiàn)場檢測需求量較大的狀況而言，植物酯酶檢測具有快速、便捷、廉價的優(yōu)點(diǎn)，不失為熱點(diǎn)開發(fā)的方法。
四、結(jié)論
建立和實(shí)施農(nóng)產(chǎn)品的市場準(zhǔn)入制度是當(dāng)前的一項(xiàng)重要工作，蔬菜中農(nóng)藥殘毒的快速檢測是其中一個重要環(huán)節(jié)，作為蔬菜大省的廣東，研究用于機(jī)磷類農(nóng)藥檢測的酯酶，是有效進(jìn)行現(xiàn)場、實(shí)時、大批次監(jiān)測的重要工作。這將為更深入研究該酶與有機(jī)磷農(nóng)藥的免疫分析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、催化機(jī)制以及植物酯酶抑制法檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量技術(shù)提供一定的提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。http://m.feta-virtual.com
